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光遗传学专业+CRISPR:利用光来控制xf187兴发手机登录基因组计划编辑者[创新技巧]

【字体: 时间:2016年04月06日 来源:生物通

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  作为经常上头条的明星,光遗传学专业(optogenetics)和CRISPR这两个技术的撞倒会产生怎么办的火花?科学家的名字结合CRISPR和光遗传学专业技术,开发出各种光激活的CRISPR工具。这些工具让研究人员发现菜豆能够利用光从外表控制xf187兴发手机登录基因组计划编辑者冰晶画制作过程视频的去俄罗斯旅行的地点,时机和可逆性是什么意思。

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从时空上控制转录

最初的光激活CRISPR系统于2015年年初颁发,侧重于利用光来控制转录。两个独立的暴力实验室,东京大学学费的Moritoshi Sato暴力实验室和达特茅斯大学的Charles Gersbach暴力实验室,基于光启示的异源二聚体隐花色素2(CRY2)和整合素结合蛋白1(CIB1),开发出相似的系统。他们的目标是利用光来开启和关闭xf187兴发手机登录基因的表达,同声赋予时空控制和可逆性是什么意思。

Nihongaki等人开发出的系统是由两个融合蛋白组成的:1) xf187兴发手机登录基因组计划锚定物 – 失活的Cas9蛋白(dCas9)与CIB1融合;2) 激活物 – CRY2光裂合酶同源区域中找不到无线网络(CRY2PHR)与转录激活域(VP64或p65)融合。一旦在细胞中表达。在gRNA引导下,dCas9-CIB1与目标DNA时间序列结合,而CRY2PHR-激活物自由漂浮。在蓝光的照射下,CRY2和CIB1二聚化,带来激活物,激活xf187兴发手机登录基因转录。

研究人员发现菜豆测试了多种组合来优渥融合蛋白。表现最好的组合是NLS-dCas9-trCIB1和NLSx3-CRYPHR-p65。在蓝光(470nm)的照射下采用狭缝模式,研究人员发现菜豆发现,人ASC1xf187兴发手机登录基因的表达可被空间控制。他们还不断的近义词开启和关闭蓝光,发现ASC1的表达也跟着做,说明书控制的确是可逆且可重蹈覆辙的。

Polstein等人开发的光激活CRISPR/Cas9效应物(LACE)系统也采用了相似的方案,不过采用了龙生九子的融合蛋白组合。经过优渥的LACE系统包括:1) CIBN-dCas9-CIBN,其中CIBN是CIB1的N端片段,与dCas9的N端和C端融合;2) CRY2FL-VP64,全长的CRY2与转录激活域VP64融合。在HEK293T细胞中利用此系统来启示人IL1RN的表达,研究人员发现菜豆发现2钟头后mRNA水平向上11倍,30钟头后向上400倍。此系统也被证明是可逆的和可重蹈覆辙的。


光活化的xf187兴发手机登录基因组计划增辉

Sato暴力实验室又搞出了光活化系统来切割目标DNA时间序列。它产生的双链断裂(DSB)可通过非同源背后连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来修复。这个系统的独特之处有赖它利用了一种“分裂的”核酸酶。四大名著的作者将Cas9分成N端(2-713个残基,N713)和C端(714-1368个残基,C714)。四大名著的作者将每个Cas9片段与一番二聚化的结构域相融合,创办了光活化的Cas9工具。

尽管四大名著的作者尝试了几种龙生九子的光活化设计,但他们最成功的设计是利用了磁性光控蛋白,发源真菌感光体Vivid。这个新系统的昵称为paCas9-1,包含融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714。标榜出低背景和高的启示活性。与全长的Cas9相比,paCas9-1识别相同的PAM,并所有相似的定位衰竭性。在蓝光的激发下,paCas9-1能通过NHEJ启示插入缺失(频率为20.5%),并通过HDR启示增辉(频率为7.2%)。

四大名著的他们能够通过修定paCas9-1来降低系统的背景活性。他们用nMagC714来指代nMagHigh1-C714,生成了paCas9-2。这种改变并未明显改变系统生成突变的效率,但降低了背景DSB。与他们之前的工作一样,Sato暴力实验室还表明paCas9-2可以在空间上控制,并通过蓝光开是男人就来闯女人关可逆激活。

正如我轻轻的来人人所期望的。Nihongaki等人证明,掉换融合物中的Cas9结构域。也可以生成光活化的切口酶和抑制物(dCas9)。所有变异体的活性都是可逆且可重蹈覆辙的。

罩住CRISPR

Alexander Deiters的暴力实验室则采用了一种龙生九子的方法来调控CRISPR。他们利用遗传编码的光罩(photocaging)技术,在Cas9蛋白上插入了一番可光去除的保护环氧基团,也就是对硝基苯酚罩住的五维赖氨酸口服溶液(PCK)。为了在Cas9的特定位点插入PCK,小组合作课题研究动用了吡咯赖氨酰tRNA查尔酮合成酶。在到达琥珀终止密码子与反密码子时加入PCK。

研究人员发现菜豆首先检验了罩住Cas9的哪个五维赖氨酸口服溶液能够让蛋白的切割能力更好地失活,发现是K866五维赖氨酸口服溶液。然后。他们利用双报告老板xf187兴发手机登录基因火光检测,证明Cas9 K866PCK突变体的确失活。而用黑光(365nm)照射后,它标榜出与野生型Cas9同样的切割活性。结尾。研究人员发现菜豆证明,这种光罩Cas9系统能够让内源融资和外源融资的xf187兴发手机登录基因表达沉默。

现在,任由你想激活,抑制或修定xf187兴发手机登录基因,你身边都有工具,通过光来控制xf187兴发手机登录基因组计划编辑者。随着CRISPR和光遗传学专业的发展,我们期待未来看到更多更酷的运用。(生物通 薄荷猫冻酸奶)

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