Cell:可逆的基因编辑技术——CRISPRoff

【字体: 时间:2021年04月12日 来源:Cell

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  一种名为CRISPRoff的新基因编辑技术允许研究人员以高特异性控制基因表达,同时保持DNA序列不变。这种方法足够稳定,可以通过数百次细胞分裂来继承,而且是完全可逆的。

  

 

   

图片:一种新的CRISPR方法允许研究人员在不改变潜在DNA序列的情况下沉默人类基因组中的大多数基因,然后逆转这些变化。

来源:Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

在过去的十年里,CRISPR-Cas9基因编辑系统彻底改变了基因工程,使科学家能够对生物体的DNA进行有针对性的改变。尽管该系统可能在治疗多种疾病方面有用,但CRISPR-Cas9编辑涉及到切断DNA链,导致细胞遗传物质的永久改变。

现在,在4月9日发表在《Cell》杂志网络版上的一篇论文中,研究人员描述了一种名为CRISPRoff的新基因编辑技术,它允许研究人员以高特异性控制基因表达,同时保持DNA序列不变。由Whitehead研究所成员Jonathan Weissman,加州大学旧金山分校助理教授Luke Gilbert,Weissman实验室博士后James Nuñez及其合作者设计,该方法足够稳定,可以通过数百个细胞分裂遗传,并且也是完全可逆的。

“重要的是,我们现在有了一个简单的工具,可以让绝大多数基因沉默,”Weissman说,他也是麻省理工学院的生物学教授和霍华德休斯医学研究所的研究员。他说:“我们可以同时对多个基因进行这项研究,而不会对DNA造成任何损伤,具有大量的同质性,而且在某种程度上可以逆转。这是控制基因表达的好工具。”

通讯合著者Gilbert说:“(从最初的拨款开始)快进四年,CRISPRoff终于按照科幻小说的设想工作了。看到它在实践中如此有效,真是令人兴奋。”

基因工程2.0

经典的CRISPR-Cas9系统使用一种细菌免疫系统中发现的名为Cas9的DNA切割蛋白。该系统可以针对人类细胞中的特定基因,使用单一的引导RNA, Cas9蛋白在DNA链上产生微小的断裂。然后细胞现有的修复机制就会修补这些漏洞。

因为这些方法改变了潜在的DNA序列,所以它们是永久性的。此外,它们依赖于“内部”细胞修复机制,这意味着很难将结果限制在单一期望的变化上。“CRISPR-Cas9虽然很漂亮,但它可以帮助修复复杂多面的自然细胞过程,”Weissman说。“结果很难控制。”

在这里,研究人员看到了一种不同类型的基因编辑器的机会——一种不改变DNA序列本身,但改变它们在细胞内读取的方式的编辑器。

这种修饰被科学家称为“表观遗传”——基因可能会因DNA链的化学变化而沉默或激活。细胞的表观遗传学问题导致了许多人类疾病,如脆性X染色体综合症和各种癌症,而且可以代代相传。

表观遗传基因沉默常常是通过甲基化——添加化学标记DNA链的某些地方——导致DNA成为访问RNA聚合酶,这种酶的DNA序列的遗传信息读入信使RNA转录,从而最终成为蛋白质的蓝图。

Weissman和他的合作者此前已经创造了另外两个表观遗传编辑器,分别是CRISPRi和CRISPRa,但这两个编辑器都有一个警告。为了让它们在细胞中起作用,细胞必须不断地表达人工蛋白来维持这些变化。

“有了这种新的CRISPRoff技术,你可以(简单地表达一种蛋白质)编写一个程序,这个程序会被细胞记住并无限期地执行,”Gilbert说。“它改变了游戏规则,所以现在你基本上是在编写一个通过细胞分裂传递的变化——在某些方面,我们可以学习创建一个更安全,同样有效的CRISPR-Cas9 2.0版本,并可以做所有这些其他事情。”

构建开关

为了构建一个可以模仿自然DNA甲基化的表观遗传编辑器,研究人员创造了一个微小的蛋白质机器,在小RNAs的引导下,可以将甲基群附着在链上的特定点上。这些甲基化基因随后被“沉默”,或被关闭,因此得名CRISPRoff。

由于这种方法不会改变DNA链的序列,研究人员可以使用去除甲基的酶逆转沉默效应,这种方法被他们称为CRISPRon。

当他们在不同的条件下测试CRISPRoff时,研究人员发现了新系统的一些有趣的特征。首先,他们可以将这种方法用于人类基因组中的绝大多数基因——而且它不仅适用于基因本身,还适用于控制基因表达但不为蛋白质编码的DNA其他区域。“这甚至对我们来说都是一个巨大的冲击,因为我们原以为它只适用于基因的子集,”第一作者Nuñez说。

此外,令研究人员惊讶的是,CRISPRoff甚至能够让没有大型甲基化区域(称为CpG岛)的基因沉默,CpG岛此前被认为是任何DNA甲基化机制所必需的。

“在这项工作之前,人们认为30%没有CpG岛的基因不受DNA甲基化的控制,”Gilbert说。“但我们的工作清楚地表明,你不需要一个CpG岛来通过甲基化关闭基因。这对我来说是一个很大的惊喜。”

研究和治疗

为了研究CRISPRoff的实际应用潜力,科学家们在诱导多能干细胞中测试了该方法。这些细胞可以根据它们接触到的分子组合在体内转变成无数种细胞类型,因此是研究特定细胞类型的发育和功能的强大模型。

研究人员选择了一种使干细胞沉默的基因,然后诱导它们转化为神经元。当他们在神经元中寻找相同的基因时,他们发现90%的细胞都保持沉默,这表明即使细胞改变了细胞类型,细胞仍然保留着CRISPRoff系统所做的表观遗传修饰的记忆。

他们还选择了一个基因作为CRISPRoff如何应用于治疗的例子:编码Tau蛋白的基因,这与阿尔茨海默氏症有关。在神经元中测试了这种方法后,他们能够证明使用CRISPRoff可以用来降低Tau蛋白的表达,尽管不是完全关闭。Weissman说:“我们所展示的是,这是一种沉默Tau蛋白并阻止该蛋白表达的可行策略。那么,问题是,你要怎么把这个东西送给成年人呢?它真的足以影响阿尔兹海默症吗?这些都是悬而未决的大问题,尤其是后者。”

即使CRISPRoff没有带来阿尔茨海默氏症的治疗方法,它也有可能应用于许多其他疾病。尽管CRISPRoff等基因编辑技术对特定组织的传递仍是一个挑战,但Weissman说:“我们证明,你可以将其作为DNA或RNA瞬时传递,这种技术也是现代RNA和生物技术冠状病毒疫苗的基础。”

Weissman等人也对CRISPRoff的研究潜力充满了热情。“因为我们现在可以让任何我们想要的基因组沉默,这是一个探索基因组功能的伟大工具,”Weissman说。

此外,拥有一个改变细胞表观遗传学的可靠系统可以帮助研究人员了解表观遗传学修饰通过细胞分裂传递的机制。Nuñez说:“我认为我们的工具可以让我们开始研究遗传机制,特别是表观遗传,这是生物医学科学中的一个大问题。”

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