Cell发布突破性可逆CRISPR技术:不改变DNA序列,沉默绝大多数基因的简单新工具

【字体: 时间:2021年04月12日 来源:生物通

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  欢迎进入CRISPR-Cas9 2.0版时代。 新型可逆CRISPR方法可控制基因表达,同时保持DNA序列不变

  

在过去的十年中,CRISPR-Cas9基因编辑系统彻底改变了基因工程领域,使科学家能够对生物体的DNA进行有针对性的改变。尽管该系统可能潜在地用于治疗多种疾病,但由于CRISPR-Cas9编辑涉及切割DNA链,会导致细胞遗传物质的永久改变,因此受到诟病。

现在,在4月9日在线发表在Cell上的一篇论文中,研究人员描述了一种称为CRISPRoff的新基因编辑技术,该技术使研究人员可以在不改变DNA序列的情况下,以高特异性控制基因表达。

该方法由Whitehead研究所Jonathan Weissman,加州大学旧金山分校Luke Gilbert,以及Weissman实验室James Nuñez等人设计完成,研究证实该方法足够稳定,可以通过数百个细胞分裂进行遗传,并且是完全可逆的!

Jonathan Weissman(美国科学院院士)是CRISPR筛选技术的先驱,他表示:“这里最重要的是,我们现在有了一个可以沉默绝大多数基因的简单工具,我们可以同时对多个基因进行操作,而不会造成任何DNA损伤,并且具有很高的同质性,而且还可以逆转。这是控制基因表达的绝佳工具!”

该项目部分由Defense Advanced Research Projects Agency于2017年提供资金资助,用于创建可逆基因编辑器。另一位通讯作者Gilbert说:“(从最初的资助开始)快四年了,CRISPRoff终于按照科幻小说的方式工作了。” “看到它在实践中如此出色,真是令人兴奋。”

CRISPR-Cas9 2.0版

经典的CRISPR-Cas9系统使用一种在细菌免疫系统中发现的称为Cas9的DNA切割蛋白。该系统可以使用单个导向RNA靶向人细胞中的特定基因,其中Cas9蛋白在DNA链中产生微小的断裂。然后,细胞现有维修工具修补上它。

这些方法会改变基本的DNA序列,而且是永久性的。另外,它们依赖于“内部”细胞修复机制,这意味着很难将结果限制为单个所需的改变。

因此研究人员开始寻找另一种基因编辑器,这种编辑器本身不会改变DNA序列,但会改变它们在细胞中读取的方式。

这种修饰就是科学家所说的“表观遗传学”——基因可能会基于DNA链的化学变化而沉默或激活。细胞表观遗传出现问题会造成许多人类疾病(例如脆弱X综合征和各种癌症),并且可以世代相传。

表观遗传基因沉默通常通过甲基化起作用,也就是将化学标签添加到DNA链的某些位置,导致DNA变得无法引入RNA聚合酶,该酶将DNA序列中的遗传信息读入信使RNA转录本,这最终可能是蛋白质的蓝图。

Weissman和合作者以前曾创建过另外两个表观遗传编辑器,称为CRISPRi和CRISPRa,但两者都存在问题。为了使它们在细胞中发挥作用,细胞必须不断表达人工蛋白质以维持变化。

“借助这项新的CRISPRoff技术,你可以编写一个程序,该程序可以被细胞无限地记住和执行。它改变了游戏规则,所以现在基本上是在写一个通过细胞分裂传递的改变。从某种意义上说,这是CRISPR-Cas9的2.0版,该版本更安全,同样有效,并且可以完成所有的和超额的工作。”

构建开关

为了构建可以模仿天然DNA甲基化的表观遗传编辑器,研究人员创建了一个微型蛋白质机器,该机器在小RNA的引导下可以将甲基粘在链的特定位点上。然后将这些甲基化的基因“沉默”或关闭,因此命名为CRISPRoff。

因为该方法不会改变DNA链的序列,所以研究人员可以使用去除甲基的酶来逆转沉默效果,他们将这种方法称为CRISPRon。

当他们在不同条件下测试CRISPRoff时,研究人员发现了新系统的一些有趣功能。一方面,他们可以将这种方法靶向人类基因组中的绝大多数基因,而且该方法不仅适用于基因本身,而且适用于控制基因表达但不编码蛋白质的DNA的其他区域。第一作者Nuñez说:“即使是对我们来说,这也是令人非常震惊的,因为我们认为这仅适用于基因的一个子集。”

此外,令研究人员惊讶的是,CRISPRoff甚至能够沉默没有被称为CpG岛的大甲基化区域的基因,该基因以前被认为是任何DNA甲基化机制所必需的。

Gilbert说:“在这项工作之前,人们曾认为30%没有CpG岛的基因不受DNA甲基化的控制。” “但是我们的工作清楚地表明,您不需要CpG岛就可以通过甲基化来关闭基因。对我来说,这是一个很大的惊喜。”

在研究和临床中的CRISPRoff应用

为了研究CRISPRoff在实际应用中的潜力,科学家在诱导多能干细胞中测试了该方法。这些细胞可以根据其所接触的分子的混合物在体内转化为无数种细胞,因此是研究特定细胞类型发育和功能的强大模型。

研究人员选择了一种在干细胞中沉默的基因,然后诱导它们转变为神经元。当研究人员在神经元中寻找相同的基因时,他们发现该基因在90%的细胞中都保持沉默,这表明即使改变细胞类型,细胞仍保留着由CRISPRoff系统进行的表观遗传修饰的记忆。

他们还选择了一个基因作为CRISPRoff如何应用于治疗的一个例子:编码Tau蛋白的基因,该基因与阿茨海默病有关。在神经元中测试了该方法之后,研究人员证明使用CRISPR-off可以降低Tau的表达,尽管不是完全关闭。Weissman说:“我们证明这是沉默Tau并阻止该蛋白表达的可行策略。” “问题是,如何将其传递到人体内?这真的足以影响阿茨海默症吗?这些问题还有待回答,尤其是后者。”

即使CRISPRoff无法完成阿茨海默症的治疗,它也可能有许多其他的应用。尽管向特定组织的递送仍然是诸如CRISPRoff之类的基因编辑技术所面临的挑战,但“我们证明了可以以DNA或RNA的形式瞬时递送,这与Moderna和BioNTech冠状病毒疫苗所基于的技术相同,” Weissman说。

Weissman,Gilbert等人也对CRISPRoff的研究潜力充满了信心。“现在可以使想要的基因组的任何部分保持沉默,所以说这是探索基因组功能的好工具。”

另外,拥有一个可靠的系统来改变细胞的表观遗传学也可以帮助研究人员了解表观遗传学修饰通过细胞分裂传递的机制。“我认为我们的工具确实使我们能够开始研究遗传力的机制,特别是表观遗传力,这在生物医学科学中是一个巨大的挑战。”

(生物通:万纹)

原文标题:

http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.025


 

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